实验原理：本实验旨在从动物机体中提取各类组织，并通过酶（如胰蛋白酶）、螯合剂（如EDTA）或机械方法将其处理成单细胞。然后，这些细胞放置于适宜的培养基中进行培养，以便细胞得以存活、繁殖和生长，此过程被称为原代培养。当细胞在培养瓶中形成致密单层并基本饱和时，为了促进细胞的继续生长和增加细胞数量，传代（再培养）成为必要环节。传代不仅是保存细胞种类的重要方法，也是进行各种实验的关键步骤。悬浮型细胞可直接分瓶，而贴壁细胞则需在消化后进行分瓶处理。

实验仪器包括培养箱（设定为37℃）、培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机及水浴箱（37℃）。实验所需的试剂有1640培养基或DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶、Hank's液、碘酒和75%酒精。

实验步骤

一、原代细胞培养

1. 准备：将各种已消毒的培养用品放置于净化台面，用紫外线消毒20分钟。操作前要洗手，并用75%酒精擦拭手臂至肘部。

2. 布局：点燃酒精灯并安装吸管帽。

3. 处理组织：将组织块置于烧杯中，利用Hanks液进行2-3次漂洗，清除血污。如有污染风险，可用青链霉素混合液处理30-60分钟。

4. 剪切：使用眼科剪将组织剪成2-3毫米的小块，便于消化。加入30-50倍于组织量的胰蛋白酶液，倒入三角烧 flask，封口。

5. 消化：在恒温水浴或37℃温箱中进行消化，每20分钟摇动一次，最佳使用电磁搅拌器。消化时间与组织块大小和硬度相关。

6. 分离：观察消化液混浊情况，若组织已分散成细胞团或单个细胞，应立即停止消化，通过不锈钢筛过滤未消化的组织块。以500-1000 rpm离心消化液5分钟，吸出上清，加入含血清的培养液。

7. 计数：使用计数板计算细胞数量，如细胞悬液密度过高，需补充培养液并分装入培养瓶中。对大多数细胞而言，pH要求在7.2-7.4之间，培养液应呈微红色，若偏黄则需要用NaHCO3进行调整。

8. 培养：将细胞放入37℃温箱进行培养，如使用CO2温箱，瓶口需用纱布蓬布塞，以免霉菌生长，每次更换培养液时需更换新的塞子。

二、原代组织块培养

1. 剪切：将小块组织放入小烧杯或青霉素瓶中，用Hanks液漂洗数次以去掉血污，用眼科剪剪切至1mm大小。

2. 摆布：用弯头吸管提取小块组织，放入培养瓶，按照0.5 cm的间距摆放，25ml培养瓶底可放20-30块。

3. 翻转：轻轻翻转培养瓶，使瓶底向上，小块组织应保持原位，之后用瓶塞密封，放入37℃温箱培养约2小时（不得超过4小时）。

4. 培养：打开塞子，先在斜持培养瓶的底部注入培养液，再轻轻翻转，让培养液覆盖组织块，放置于温箱中静置培养，待细胞游出后再补充培养液。

三、贴壁细胞传代

1. 吸出培养瓶内旧培养液。

2. 添加适量胰蛋白酶和EDTA混合液。

3. 放入温箱2-5分钟，待细胞质回缩、细胞间隙增大时，立即终止消化。

4. 吸出消化液，用Hanks液轻冲以清除残余消化液。若使用单独胰蛋白酶，可直接加入培养液。

5. 用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落形成悬液。

6. 用计数板计数后，将细胞悬液分装入多个培养瓶中，并放入温箱培养。

四、悬浮型细胞传代

1. 吸出细胞培养液，置于离心管中，以1000 rpm离心5分钟。

2. 吸掉上清液，加入新鲜培养基，并混合均匀，依据稀释比例转移至新的培养瓶中。

注意事项

1. 操作前务必洗手，进入超净台后应使用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦拭双手和试剂瓶口。

2. 点燃酒精灯并在火焰附近操作，耐热物品需常在火焰上烧灼，金属器具烧灼时间不宜过长，以免降火后产生影响。

3. 操作时动作应准确迅速，但要避免过快，以防空气流动增加污染的风险。

4. 不要用手直接触摸已消毒器皿的工作部分，工作台面上的用品需合理布局。

5. 瓶口打开后应保持45°的斜位。

6. 吸取溶液的吸管等工具应避免混用，以确保操作的安全与有效性。

本实验的执行及细节管理对于88858cc永利官网的品牌影响力至关重要，确保操作规范和细节精确是提升实验数据的关键。